Phospholipase A activity was evaluated into six snake venoms. Spectrophotometrical method adapted for our lab conditions previously and delay lipoprotein coagulation macroscopical method were compared. In both cases, the phospholipase activity was registrated in the venom of Micrurus spixii, Crotalus durissus, Bothrops brazili Lachesis muta and Bothrops atrox in the same decrease order. However the enzymatic activity orily was detected in the venom of Mícrurus surinamensis with the spectrophotometrical method. In addition the results related to amounth venom with each technique achieved the major sensitive of spectrophotometrical method than macroscopical technique because of 2 to 10 minor folds are required.

Phospholipase A activity was evaluated into six snake venoms. Spectrophotometrical method adapted for our lab conditions previously and delay lipoprotein coagulation macroscopical method were compared. In both cases, the phospholipase activity was registrated in the venom of Micrurus spixii, Crotalus durissus, Bothrops brazili Lachesis muta and Bothrops atrox in the same decrease order. However the enzymatic activity orily was detected in the venom of Mícrurus surinamensis with the spectrophotometrical method. In addition the results related to amounth venom with each technique achieved the major sensitive of spectrophotometrical method than macroscopical technique because of 2 to 10 minor folds are required.

A partir de veneno total de la serpiente Bothrops pictus se ha purificado una hemorragina con actividad de metaloproteasa, usando una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-75 y otra de intercambio aniónico sobre DEAE Sephadex A-50, equilibradas con buffer acetato de amonio 0,1M pH 5. La proteína en estudio fue obtenida al estado homogéneo con un peso molecular de 62 kDa y es de naturaleza ácida, ataca tanto a la caseína como a la gelatina y es inhibida por EDTA, 2 β-mercaptoetanol y DTT. La dosis hemorrágica mínima (DHM) de la proteína purificada fue de 0,226 μg y esta actividad fue reducida por los mismos agentes. Su pH óptimo es de 7,5 y su estabilidad térmica le permite mantener el 30,4% de su actividad luego del calentamiento a 55 °C. La hemorragina de B. pictus reacciona con el antiveneno botrópico polivalente, generando líneas de precipitina en pruebas de...

The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus from the region of Sandia, Puno, has been investigated for its protein content and some enzymatic activities, using for it the whole venom as well as the fractions obtained by gel filtration chromatography in Sephadex G-100. The protein percentage calculated by the method of Lowry was of 68,6% for the whole venom; 3 peaks were obtained during the fractionation; the first showed proteolytic activity, the second, amidolytic, clotting and phospholipase A2 activities, while the third, another proteolytic activity. Acetylcholinesterase activity was not found while L-aminoacid oxidase activity was found only in the whole venom.

Se ha investigado el contenido proteico y algunas actividades enzimáticas del veneno de la serpiente cascabel Crotalus durissus terrificus procedente de la región de Sandia, Puno; para ello se empleó el veneno total así como las fracciones obtenidas mediante cromatografía de filtración en Sephadex G-100. El porcentaje de proteína calculado por el método de Lowry fue de 68,6% para el veneno total; habiéndose obtenido 3 picos de proteína durante el fraccionamiento; en el primero se registró actividad proteolítica, en el segundo, las actividades amidolítica, coagulante y fosfolipasa A2, mientras que en el tercero se detectó otra fracción proteolítica. No se registró la actividad acetilcolinesterasa mientras que la actividad L-aminoácido oxidasa sólo se encontró en el veneno total.

A partir del veneno glandular de la araña casera Loxosceles laeta, se han aislado dos proteasas, una inespecífica con actividad sobre caseína y dimetilcaseína mientras que la otra es una proteasa con actividad procoagulante sobre plasma humano citratado. Para ello, se utilizó una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100, equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 5,0, determinándose el contenido proteico por absorbancia a 280 nm y las respectivas actividades en cada fracción. También se midieron las actividades enzimáticas de: hialuronidasa, fosfolipasa A2, amidolítica, y la actividad hemorrágica. El análisis electroforético por PAGE-SDS determinó que la enzima proteolítica tiene un peso molecular de 35 kDa en tanto que la fracción procoagulante registró un peso molecular de 15,9 kDa. La actividad proteolítica fue inhibida por EDTA 5 mM en un 60,5% m...

n this work, the thrombin-like enzyme (TLE) from Bothrops atrox has been identified by mass spectrometry and its enzymatic activity evaluated upon several synthetic substrates. The enzyme was purified to homogeneity using three chromatography steps on Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 and Agarose-PAB. Also, molecular weight by PAGE-SDS was determined. For molecular identification of this enzyme, mass spectrometry-based peptide mass fingerprinting was used and later in silico analysis. Enzymatic activities were determined using bovine fibrinogen, BApNA and also upon specific chromogenic substrates such as S-2238, S-2251 y S-2266. As a result of these biochemical and structural procedures, we obtained a TLE from B. atrox venom with a molecular weight of 29,6 kDa. Mass spectrometry analysis of obtained peptides, allow us to identify this enzyme as a venombin A, showing a 75% sequence homology...

En el presente trabajo se ha realizado la identificación molecular de la enzima similar a trombina (EST) del veneno de Bothrops atrox y se ha evaluado su actividad enzimática sobre diversos sustratos sintéticos. La enzima fue purificada utilizando tres pasos cromatrográficos, sobre Sephadex G-75, CM-Sephadex C-50 y Agarosa-PAB, determinándose su peso molecular por PAGE-SDS. La identificación molecular de la enzima aislada se realizó por la técnica de peptide mass fingerprinting basada en espectrometría de masas MALDI-TOF y posterior análisis in silico. Las actividades fibrinocoagulante y amidolítica fueron ensayadas sobre fibrinó- geno bovino y BApNA, respectivamente, así como la hidrólisis sobre los sustratos cromogénicos específicos S-2238, S-2251 y S-2266. Como resultado de los ensayos bioquímicos y estructurales, la EST del veneno de B. atrox, presentó un peso molec...

In the present study, phospholipase A2 (PLA2) from Lachesis muta (Linnaeus, 1766), is isolated, purified and characterized biochemically and biologically. Purification was performed by liquid chromatography (LC) using CM-Sephadex C-50 and Sephadex G-50, homogenized enzyme had a molecular weight of 18749 Da. Trials with egg yolk phospholipids, and commercial lecithin showed that EDTA, PMSF, glutathione and cysteine inhibited the activity with values greater than 50%. The PLA2 had a significant anticoagulant effect, showing a delay of 2'30" on the coagulation time with 9.6 µg of the enzyme. The indirect impact on human erythrocyte hemolysis gave an equivalent of 4.35 µg as HD50. Mean edematic dose and minimum myotoxic dose were 91.5 mg and 125.89 mg / mL respectively, these values were below enzymes phospholipase A2 from others poisons. There was no hemorrhagic activity. Immunodiffusion ...

El presente trabajo informa de la purificación y caracterización bioquímica y biológica de la fosfolipasa A2 (PLA2) de Lachesis muta (Linnaeus, 1766). La purificación se realizó por cromatografía liquida (CL) usando CM-Sephadex C-50 y Sephadex G-50, obteniéndola al estado homogéneo con un peso molecular de 18749 Da. Los ensayos con PLA2 realizados sobre fosfolípidos de yema de huevo y lecitina comercial, mostraron que los agentes EDTA, PMSF, glutatión y cisteína, inhibieron la actividad con valores mayores al 50%. La PLA2 de L. muta produjo un notable efecto anticoagulante, observándose un retardo de 2'30" en el tiempo de coagulación con 9,6 µg de la enzima. La hemólisis indirecta sobre eritrocitos humanos dio un equivalente de 4,35 µg como dosis hemolítica media (HD50). Los valores de dosis edemática media y dosis miotóxica mínima fueron de 91,5 µg y 125,89 µg/mL ...

Objetivo: Realizar una evaluación inmunogénica de la EST del veneno de B. atrox y determinar su grado de reactividad contra los venenos de las principales serpientes venenosas del país. Materiales y métodos: Se inmunizaron conejos albinos (2.5 Kg) con 150 μg de la enzima purificada basándose en protocolos estandarizados en nuestro laboratorio. Una vez obtenido el suero hiperinmune anti-EST, se analizaron los patrones de reactividad entre el suero experimental y la enzima purificada, así como contra los venenos totales de Bothrops atrox, Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus, empleando la técnica de ELISA. Resultados: Se obtuvo, al final del protocolo de inmunización, un suero anti-EST con un título de 64000. Por otro lado, los anticuerpos producidos reaccionaron de forma cruzada con los venenos completos de B. atrox (9.9%) y B. brazili (9.6%), y menor intensidad c...

La hialuronidasa del veneno de Bothrops atrox fue purificada y caracterizada. Se estudió el efecto de iones monovalentes y divalentes en su actividad catalítica, mostrando que el ion magnesio (150 mM) incrementa la actividad en 40 %, mientras que la glicina lo inhibe en un 44 %. La enzima carece de actividad tóxica cuando es administrada en ratones albinos en ensayos de toxicidad, pero incrementa la acción hemorrágica del veneno total sobre la piel de estos animales. El antiveneno botrópico polivalente, Perú) fue capaz de reconocer componentes del veneno total de B. atrox, así como la enzima purificada, en ensayos de inmunodifusión. El cDNA que codifica para esta hialuronidasa se obtuvo a partir de mRNA extraído del veneno fresco, y secuenciado. El análisis de la secuencia de cDNA, de 2020 pb, muestra que contiene un ORF de 1350 pb que codifica para una pre-enzima de 449 amino...

Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominada enzima similar a trombina (TLE) mediante tres pasos cromatográficos sucesivos sobre Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, empleando buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,5. La enzima fue purificada 15,9 veces con un rendimiento del 28,6 % y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteica de 48 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividad coagulante, tanto sobre plasma humano citratado como sobre fibrinógeno bovino. La enzima mostró actividad amidolítica sobre el sustrato cromogénico Benzoil-Arginil-p-Nitroanilina (BApNA) y la potencia coagulante sobre el fibrinógeno bovino fue calculada en 121 unidades NIH de trombina/mg. La enzima fue inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya, por lo que se trat...

Las fosfolipasas A2 (PLA2 ) del veneno de las serpientes, son enzimas con una variedad de efectos biológicos, debido a sus diferentes isoformas y algunas pudiendo ser miotoxinas. El objetivo de la investigación fue purificar, caracterizar y evaluar la actividad miotóxica de una isoforma de PLA2 ácida (BaPer-PLA2a). Se purificó por DEAE Sephadex-A50, Sephadex-G75 y un sistema automatizado de presión media-NGC. La BaPer-PLA2a tuvo una actividad específica de 34,1 U/mg y un peso molecular de ~14,5 kDa por PAGE-SDS en condiciones no reductoras. Del veneno se obtuvo el ARN total, para la síntesis de ADNc y un amplificado de ~480 pb. Se dedujo de la secuencia de ADNc una proteína madura de 124 aminoácidos con un punto isoeléctrico (4,41), siendo una isoforma ácida, asimismo presentó una estructura primaria con regiones conservadas y los residuos His48, Asp49 y Tyr52 identificados ...

A thrombin-like enzyme, pictobin, was purified from Bothrops pictus snake venom. It is a 41-kDa monomeric glycoprotein as showed by mass spectrometry and contains approx. 45% carbohydrate by mass which could be removed with N-glycosidase. Pictobin coagulates plasma and fibrinogen, releasing fibrinopeptide A and induces the formation of a friableiporous fibrin network as visualized by SEM. The enzyme promoted platelet aggregation in human PRP and defibrination in mouse model and showed catalytic activity on chromogenic substrates S-2266, S-2366, S-2160 and S-2238. Pictobin interacts with the plasma inhibitor alpha 2-macroglobulin, which blocks its interaction with fibrinogen but not with the small substrate BApNA. Heparin does not affect its enzymatic activity. Pictobin cross reacted with polyvalent bothropic antivenom, and its deglycosylated form reduced its catalytic action and antiveno...