Remoción de mercurio de suelos contaminados por actividades mineras en el distrito de Mariano Nicolás Valcárcel anexo de Secocha, empleando cepas bacterianas nativas y su evaluación como potenciales agentes de biorremediación

• Autor: Lopez Casaperalta De Diaz, Patricia Yaneth
• Formato: tesis doctoral
• Fecha de Publicación: 2021
• Institución: Universidad Nacional de San Agustín
• Repositorio: UNSA-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.unsa.edu.pe:20.500.12773/13020
• Enlace del recurso: http://hdl.handle.net/20.500.12773/13020
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Remoción de mercurio; biorremediación; cepas bacterianas nativas; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#2.08.02

Las actividades mineras desarrolladas en el anexo de Secocha originan un grave impacto ambiental y un constante peligro para la salud de los pobladores, esto debido a los vertimientos de desechos y al uso del mercurio para la recuperación del oro incorporados en el medio ambiente. Los metales pesados como el Hg son especies químicas que una vez volcados en el medio ambiente, se dispersan y acumulan en el aire - agua - suelo, a veces cambiando su estado de oxidación o incorporándose en los seres vivos. Debido a la actividad productiva y al vertimiento de desechos mineros en el Anexo de Secocha, surge el desarrollo de la presente investigación con el objetivo de identificar cepas bacterianas nativas de suelos contaminados por actividades mineras, con capacidad de crecimiento en sustratos con mercurio para evaluar su comportamiento y su capacidad de remoción de mercurio El desarrollo de la investigación se dio inicio con el cultivo y aislamiento de cepas bacterianas, posterior a ello se realizaron los ensayos y los análisis de laboratorio necesarios para demostrar los objetivos e hipótesis establecida. Los medios de cultivo usados fueron agar nutritivo y agar sangre, medios en los cuales se agregó una suspensión HgCl2 en agua destilada desionizada estéril. El sembrado de bacterias se realizó a partir de la preparación de 10 gramos de suelo contaminado con presencia de mercurio y 10 mL. de agua destilada estéril, la relación fue de 1:1. El método empleado para el sembrado de las muestras fue por agotamiento en placas Petri, los medios de pre enriquecimiento fueron agar nutritivo con (5ppm de HgCl2) y agar sangre (5 ppm de HgCl2), la temperatura de incubación fue a 37°C. Luego de 10 repeticiones se obtuvo las colonias puras, las mismas que fueron preparadas para la extracción de ADN. Los resultados del ADN identificaron tres tipos de cepas bacterianas las cuales inicialmente las denominaremos como T1.1, T2.2 y T3. Según el porcentaje de similitud registrado en el banco de genes (NCBI), la colonia T1.1 al 98.66% presento una similitud con el género Kocuria Rosea, la Colonia T3 al 98.19% presento una similitud con el género Zhihengliuella alba y la colonia T2.2 presento una similitud al 98.67% también con el género de Zhihengliuella alba. El electroferograma de las tres cepas fue realizado con un secuenciador automático ABI 3730XL DNA Analyzer que trascribe los signos fluorescentes y fueron graficados en BioEdit Sequence Alignment Editor. El antibiograma de las cepas en estudio fue realizado siguiendo el procedimiento de Bauer-Kirby, este método ha sido estandarizado con el Agar Müller – Hinton. Para los análisis se usaron los antibióticos (ciprofloxacina, lincomicina, azitromicina, amikacina, amoxicilina, levofloxacina, enrofloxacina, amoxicilina + clavulánico). Luego de la preparación de la suspensión de las colonias se colocaron los discos de antibióticos seleccionados en la superficie del medio ya inoculado. La placa Petri con el inóculo y los discos de sensibilidad en la superficie fueron incubados por 48 horas a 37ºC, pasado ese tiempo se realizó la lectura y la medición de los halos de inhibición, mostrando que la cepa bacteriana T1.1 tuvo mayor sensibilidad a la ciprofloxacina, levofloxacina, enrofloxacina, la cepa bacteriana T2.2 mostro sensibilidad a la ciprofloxacina, lincomicina, azitromicina, levofloxacina, enrofloxacina y finalmente la cepa bacteriana T3 mostro sensibilidad a amoxicilina, levofloxacina y amoxicilina+acido clavulánico. Las secuencias encontradas, se compararon con las almacenadas en GENBANK, luego de este proceso se alinearon las secuencias con los scores más altos (Max ident), mediante la ayuda del método Neighbor-Joining. Para la obtención de las secuencias bacterianas se empleó el algoritmo Nucleotide Web BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) y Sequence Match en donde se centraron regiones de similitud entre secuencias biológicas, a partir de los trayectos calculados se construyeron los árboles filogénicos de cada una de las cepas bacterianas encontradas. En referencia a las colonias T1.1, T3, T2.2 se identificó similitudes que oscilaron entre 98.67% y 94.39% comparadas con las 10 primeras cepas bacterianas. El proceso de alineamiento se realizó por medio de BLAST bajo los parámetros del programa MEGA mencionado por Kumar y Col, 2004. El árbol Filogenético se ha diseñado mediante el método Neighbour-joining (Saito y Nei, 1987) y el modelo Kimura-2. El alineamiento de las secuencias fue realizado por medio ClustalW, las secuencias en estudio se ingresaron al Programa Mega con la finalidad de relacionarlas con sus similares de especies bacterianas del mismo género. Finalmente, el análisis experimental para evaluar la capacidad de remoción de mercurio se realizó con agua tratada en laboratorio en donde se inoculo las cepas bacterianas en una solución madre a 162 ppm de mercurio, las muestras fueron incubadas a 12, 24, 48, 720 y 1080 horas. En donde se evidencio una capacidad de remoción de mercurio con valores que fueron desde una concentración de 162 ppm hasta una concentración de 98 ppm en el caso de la cepa bacteriana T2.2 con un porcentaje de remoción de mercurio de 39.5%. En el caso de la cepa T1.1 la remoción le permitió llegar a 116 ppm equivalente a un porcentaje de 28.4% y en el caso de la cepa bacteriana T3 la remoción llego a 108 ppm equivalente a un porcentaje de 33.3%. Los resultados de los ensayos mostraron que los valores de remoción de mercurio se incrementaron en función del tiempo. Los resultados experimentales para analizar la remoción de mercurio fueron obtenidos mediante el método de análisis de espectrometría de absorción atómica con la técnica de vapor frio. La estadística muestra el efecto del tiempo con respecto a la concentración de mercurio. La prueba de especificidad de Tukey mostro que la mayor remoción de mercurio se encontró con la cepa bacteriana T2.2 además se mostró que esta difiere significativamente (P<0.05) de la remoción de mercurio de las cepas T1.1 y T3. Asimismo, se evidencio que la remoción de mercurio con la cepa T1.1 y T3 no tienen diferencias estadísticas significativas (P>0.05). Luego de desarrollar la presente investigación, se demostró que las bacterias nativas presentes en los suelos contaminados de Secocha y en general los microorganismos autóctonos presentes en los suelos contaminados por actividades mineras son la clave para resolver la mayoría de los desafíos asociados con la biodegradación y la biorremediación de sustancias contaminantes (Verma y Jaiswal, 2016).