STANDARDIZATION AND VALIDATION OF QUALITATIVE REAL TIME RT-PCR FOR DETECTION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

• Autores: Chiok C., Kim Lam, Manchego S., Alberto, Rivera G., Hermelinda, Sandoval Ch., Nieves, Ramírez V., Mercy
• Formato: artículo
• Fecha de Publicación: 2011
• Institución: Universidad Nacional Mayor de San Marcos
• Repositorio: Revista UNMSM - Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:ojs.csi.unmsm:article/337
• Enlace del recurso: https://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/veterinaria/article/view/337
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: porcine; classical swine fever virus; CSFV; real time RT-PCR; virus isolation; validation; Porcino; virus de la peste porcina clásica; VPPC; RT-PCR en tiempo real; aislamiento viral; validación

Se estandarizó y validó la técnica de Transcriptasa Reversa - Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-T-PCR) en tiempo real para el diagnóstico de la Peste Porcina Clásica (PPC). Se utilizó extractos de tonsilas y nódulos linfáticos de porcinos positivos (n=36) y negativos (n=30) a PPC mediante inmunofluorescencia (IF). La extracción de ARN viral, síntesis del ADN complementario y PCR en tiempo real se realizaron utilizando kits comerciales. Se utilizaron tres pares de cebadores para amplificar una región conservada (5’UTR) del virus PPC (VPPC) y del panpestivirus (virus de la DVB y EF) y una región codificante de la proteína E2 del VPPC frente a cepas de referencia del VPPC Alfort/187, Brescia y cepa China vacunal como controles positivos y cepas de los virus diarrea viral bovina, enfermedad de la frontera y rotavirus porcino como controles negativos. El 83.3 ± 12.3% (30/36) de las muestras positivas al VPPC por IF resultaron positivas al aislamiento y el 96.7 ± 3.3% (29/30) de las muestras negativas al VPPC por IF fueron negativas al aislamiento. Los resultados de la técnica de RT-PCR en tiempo real se determinaron mediante el análisis de las curvas de amplificación y disociación entre los controles positivos, negativos y las muestras de tejidos positivos y negativos al VPPC. Los cebadores E2 del VPPC dieron mejores resultados al reconocer los controles positivos y negativos. La técnica RT-PCR en tiempo real fue capaz de detectar al menos 4.28 pg de ARN de la cepa Brescia de la PPC. La validación se realizó comparando los resultados de las muestras positivas y negativas al aislamiento viral con los resultados de la RT-PCR en tiempo real. La prueba tuvo una sensibilidad de 96.8 ± 6%, y especificidad de 82.9 ± 12%, un valor predictivo positivo de 83.3 ± 12.3%, y negativo de 96.7 ± 3.3%. La técnica RTPCR en tiempo real es una herramienta diagnóstica con alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la PPC.
A real time RT-PCR assay was standardized and validated for detection of classical swine fever virus (CSFV). Tonsil tissue and lymph nodules that were positive (n=36) and negative (n= 30) to CSFV by immunofluorescence test (IF) were selected. The viral RNA extraction, the complementary DNA (cDNA) synthesis and real time RT- PCR were performed using commercial kits. Three sets of primers were tested for amplification of a conserved region (5’UTR) of panpestivirus and 5’UTR Chinese strain and the E2 glycoprotein region (E2 PPC) against reference strains of CSFV: Alfort/187, Brescia, and a vaccine Chinese strain as positive controls, and strains of the bovine viral diarrhea virus, border disease virus and porcine rotavirus as negative controls. The 83.3 ± 12.3% (30/36) of positive simples to CSFV by IF test was positive for virus isolation and the 96.7 ± 3.3% (29/30) of negative samples to CSFV by IF was negative for virus isolation. The results of real time RT-PCR assay were determined by the analysis of cycle threshold (Ct) and temperature of melting (Tm) values between the positive and negative controls and the positive and negative to CSFV of field samples. The primer E2 of CSFV recognized all positive and negative controls. The real time RT-PCR assay detected at least 4.28 pg of RNA of CSFV Brescia strain. The validation of the real time RT-PCR was performed comparing the results of positive and negative to CVSFV by isolation test and the results of real time RT-PCR assay. The real time RT-PCR assay had a sensitivity of 96.8 ± 6%, specificity of 82.9 ± 12% and a predictive positive and negative value of 83.3 ± 12.3% and 96.7 ± 3.3% respectively. The real time RT-PCR assay has a high sensitivity and specificity for the diagnosis of CSFV.