PCR acoplada a CRISPR-Cas12A para la detección de los genes de resistencia CTX-M-15 y floR en Escherichia coli: prueba de concepto

• Autor: Vargas Reyes, Maryhory Fiorella
• Formato: tesis de maestría
• Fecha de Publicación: 2023
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/15029
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/15029
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: PCR; CRISPR; Cas12a; RAM; floR; blaCTX-M-15; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.07

Estudios recientes sobre la resistencia antimicrobiana han reportado una alta prevalencia de los genes de resistencia blaCTX-M-15, los cuales producen resistencia a betalactámicos, antibióticos de uso humano, y floR, que confiere resistencia a florfenicol, un antibiótico de uso veterinario, proponiéndolos como biomarcadores de la resistencia antimicrobiana (RAM). Estos genes se encuentran en bacterias E. coli provenientes de muestras de humanos, animales y aguas residuales, acentuando la necesidad de que sean monitoreados. Desafortunadamente, la mayoría de los laboratorios se encuentran limitados de adquirir y mantener equipos de alta tecnología, como las plataformas de secuenciación de próxima generación para el monitoreo de la RAM. En este estudio, se desarrolló una técnica de detección molecular de los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR en E. coli enterotoxigénica (ETEC) basados en la tecnología CRISPR-Cas12a acoplada a la a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando equipos básicos, como un termociclador y un transiluminador. Para ello, se diseñaron el ARNcr y los cebadores de las regiones conservadas de los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR, mediante análisis bioinformático. Además, se optimizó un sistema de amplificación de ácidos nucleicos y de detección fluorescente mediante CRISPR-Cas. En la determinación del límite de detección, se demostró que la técnica puede detectar concentraciones de ADN diana tan bajas como 100 aM en una reacción de PCR con 30 ciclos de amplificación y un tiempo de detección de 1.5 horas. Finalmente, al comparar la técnica PCR-CRISPR-Cas12a para los genes de resistencia blaCTX-M-15 y floR con los métodos difusión en disco y la microdilución, respectivamente, nuestros resultados también mostraron una buena concordancia con un índice de kappa de 1 (p < 0.001). La aplicación de la técnica aquí descrito se perfila como una opción prometedora para la detección de genes de resistencia antimicrobiana en entornos con recursos limitados, lo que contribuiría a una mejor vigilancia y control de la RAM.