Caracterización Estructural y Funcional de una Fosfolipasas A2 Homóloga K49 del Veneno de Bothrops barnetti, por Aproximación Proteómica

• Autor: Arenas Menéndez, Luis Angel
• Formato: tesis de grado
• Fecha de Publicación: 2018
• Institución: Universidad Católica de Santa María
• Repositorio: UCSM-Tesis
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.ucsm.edu.pe:20.500.12920/7749
• Enlace del recurso: https://repositorio.ucsm.edu.pe/handle/20.500.12920/7749
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Bothrops barnetti; fosfolipasas A2; homologas k49; espectrometría de masas; secuenciación; IL-1, IL-6, TNFα.

Las Fosfolipasas A2 (PLA2) forman parte de un selecto grupo de enzimas que realizan un papel indispensable en los diversos procesos celulares y fisiológicos de los organismos vivos pluricelulares. Estas enzimas intervienen en señales de transducción que activan distintos procesos como son la contracción de músculo liso, otras activan la cascada de inflamación mientras otras intervienen en procesos digestivos del intestino, procesando lípidos para su posterior absorción. Dentro de este grupo de fosfolipasas existe un subgrupo de proteínas conocido como “PLA2 homólogas”, las cuales no ejercen actividad catalítica debido a una mutación que ocurre en un aminoácido del sitio activo; pero aunque estas toxinas carecen de acción lipolítica, producen efectos biológicos similares a los de sus homólogas catalíticamente activas, entre los cuales se destacan la miotoxicidad y la inflamación. En el presente trabajo de investigación se buscó encontrar por lo menos una PLA2 homóloga K49 en el veneno total de Bothrops barnetti peruana, mediante una columna de interacción hidrofóbica se obtuvieron diversas enzimas, las cuales por un análisis de actividad pro-inflamatoria y una electroforesis en SDS-PAGE fue posible aislar una muestra de aproximadamente 14 kDa en ausencia de actividad fosfolipásica en relación al resto, la cual fue denominada como BbTX-II. Seguidamente se procedió a determinar la masa de la muestra por espectrometría de masas Electrospray (ESI) obteniendo de esta manera un peso de 14242 kDa para la muestra en estudio. Con el uso de una espectrometría de masas MALDI-TOF se realizó una caracterización de la estructura primaria, secuenciando los aminoácidos de 3 péptidos obtenidos, para finalmente realizar un estudio de homología secuencial (análisis bioinformático) con el uso de la base de datos SWISS-PROT para determinar que la muestra en estudio BbTX-II es una PLA2 homóloga K49. Paralelamente se realizó una caracterización biológica de la muestra BbTX-II para así determinar el efecto miotóxico de la misma; evaluando de esta manera los mediadores envueltos en la migración leucocitaria y en el efecto inflamatorio como son la IL-1, IL-6 y TNFα, observando un aumento de los mediadores dentro de las primeras 3 horas; determinando así un efecto local de la muestra. Palabras clave: Bothrops barnetti, fosfolipasas A2, homologas k49, espectrometría de masas, secuenciación, IL-1, IL-6, TNFα.