Evaluación y validación del método de agrupamiento para la detección de SARS CoV-2 mediante RT PCR en muestras nasofaríngeas-orofaríngeas y de saliva

• Autor: Lizarraga Vargas, Luis Carlos
• Formato: tesis doctoral
• Fecha de Publicación: 2024
• Institución: Universidad Nacional de San Agustín
• Repositorio: UNSA-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.unsa.edu.pe:20.500.12773/18846
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12773/18846
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: COVID 19; agrupamiento; saliva; ciclo umbral; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03

El presente estudio de investigación es sobre la evaluación del método de agrupamiento (pooling) para la detección de Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus 2 (SARS CoV-2) mediante la técnica molecular de Transcriptasa reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT PCR) y la comparación de los resultados de muestras nasofaríngeas orofaríngeas frente a la muestra de saliva. Se analizaron 93 muestras de pacientes voluntarios que cumplieron con los criterios de inclusión para este estudio de investigación, los cuales donaron una muestra-nasofaríngeas orofaríngeas y una muestra de saliva. Se realizó la extracción y purificación del RNA y, a continuación, se amplificó, dos segmentos del material genético del Síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus 2 (SARS CoV-2), el Gen del nucleocápside (Gen N) y el segmento Open Reading Frames 1ab (ORF1ab) mediante la técnica RT PCR, se analizó los valores umbrales (Ct) de cada muestra, se llegó a detectar 24 muestras positivas y 69 muestras negativas para ambas muestras biológicas analizadas. Del grupo de 24 muestras positivas, se seleccionaron 15 muestras para realizar el agrupamiento de los tamaños de 5, 10, 15 y 20, tanto para las muestras nasofaríngeas-orofaríngeas y muestras de saliva. En el análisis estadístico realizado utilizando la prueba "t" de Student se compararon los valores umbrales de número de ciclos (Ct) para el Gen N y los segmentos ORF1ab entre las muestras nasofaríngeas-orofaríngeas y las muestras de saliva. Los resultados no revelaron diferencias significativas (p > 0.05). Específicamente, los valores promedio de Ct para el gen N fueron 39.78 ± 9.69 en las muestras nasofaríngeas-orofaríngeas y 39.99 ± 9.34 en las muestras de saliva. De manera similar, los valores promedio de Ct para el segmento ORF1ab fueron 40.09 ± 9.02 en las muestras de saliva y 39.94 ± 9.27 en las muestras nasofaríngeas-orofaríngeas. Estos hallazgos indican que ambos tipos de muestras presentan una consistencia comparable en la detección de estos segmentos virales. En los agrupamientos de muestras de hisopado nasofaríngeas-orofaríngeas de tamaño de 5 (Ct X̅ ± σ para el gen N 27.59 ± 7.81 y para ORF1ab 28.53 ± 7.34), 10 (Ct X̅ ± σ para el gen N 28.71 ± 8.36 y para ORF1ab 29.89 ± 7.93), 15 (Ct X̅ ± σ para el gen N 31.38 ± 10.00 y para ORF1ab 32.26 ± 9.18) y 20 (Ct X̅ ± σ para el gen N 32.45 ± 10.18 y para ORF1ab 33.58 ± 9.64), en comparación con la muestra unitaria (Ct X̅ ± σ para el gen N 26.97 ± 7.98 y para ORF1ab 33.58 ± 9.64), no se observaron diferencias significativas (p>0.05) en los valores de Ct del gen N entre los diferentes tamaños de agrupamiento, con un valor de F de 2.15 para la variabilidad entre los grupos. Sin embargo, en el caso del Ct del segmento viral ORF1ab, se identificaron diferencias significativas (p<0.05) entre los diferentes tamaños de agrupamiento, con un valor de F de 2.57 para la variabilidad entre los grupos utilizando la prueba estadística de ANOVA. Esto indica que, mientras que el método de agrupamiento no afecta significativamente la detección del gen N, sí tiene un impacto en la detección del segmento ORF1ab. En los análisis de agrupamientos de muestras de saliva en tamaños de 5 (Ct X̅ ± σ para el gen N 28.69 ± 7.89 y para ORF1ab 28.95 ± 7.45), 10 (Ct X̅ ± σ para el gen N 29.62 ± 8.22 y para ORF1ab 29.98 ± 7.87), 15 (Ct X̅ ± σ para el gen N 31.79 ± 9.67 y para ORF1ab 32.13 ± 9.24) y 20 (Ct X̅ ± σ para el gen N 32.96 ± 9.75 y para ORF1ab 33.58 ± 9.55), en comparación con la muestra unitaria (Ct X̅ ± σ para el gen N 27.78 ± 7.87 y para ORF1ab 28.48 ± 7.30), no se detectaron diferencias significativas (p > 0.05) en los valores de Ct de los segmentos virales gen N y ORF1ab. Los valores de F de variabilidad entre los grupos fueron de 1.84 y 2.03 respectivamente, indicando una consistencia en los resultados independientemente del tamaño del grupo de muestras analizadas. Según el análisis de correlación de Pearson entre las muestras unitarias y los agrupamientos tanto de hisopado nasofaríngeas-orofaríngeas como de saliva, se observa que los agrupamientos de tamaño 5 (r = 0.99) y 10 (r = 0.99) muestran una correlación altamente significativa (p<0.01) con las muestras unitarias. Esto indica una consistencia notable en los ciclos umbrales para el gen N y ORF1ab en muestras unitarias y agrupadas. Basándonos en los hallazgos obtenidos, se llega a la conclusión de que la muestra de saliva emerge como una alternativa viable para realizar agrupamientos de 5 y 10 muestras, lo que contribuye significativamente a la reducción del tiempo de respuesta y los costos asociados para el diagnóstico molecular de la enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19).