Evaluación de herramientas para el control de la fasciolosis bovina: prueba diagnóstica por amplificación isotérmica mediada por bucle y actividad trematicida del extracto de Allium sativum

• Autor: Burga Cisterna, Cesar Abel
• Formato: tesis doctoral
• Fecha de Publicación: 2023
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/15359
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/15359
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: In Vitro; LAMP; Precisión Diagnóstica; Fasciola hepatica; Perú; http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.07; http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.08; http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.09; http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#4.03.00

La fasciolosis es una de las parasitosis hepáticas más importantes del país. Actualmente, las principales limitaciones del control de esta enfermedad son el correcto diagnóstico y la progresiva resistencia al triclabendazol, que es el fármaco recomendado para su tratamiento. Por tal motivo, el presente trabajo propone i) desarrollar y evaluar la precisión diagnóstica de LAMP (Loop-Mediated isothermal amplification) aplicando una optimización en la extracción de ADN en heces de bovinos y ii) evaluar la eficacia fasciolicida in vitro de los extractos de ajo. Investigación 1: Estudio donde se desarrolla una nueva prueba LAMP optimizando la extracción de ADN evaluando su precisión diagnóstica. Se optimizó la técnica de extracción de ADN para F. hepatica combinando la técnica coprológica de sedimentación (concentración de huevos de F. hepatica) y la técnica de lisis con perlas de Zirconia/Silica en un homogenizador de alta velocidad a 6m/s durante 40 seg; estas dos técnicas se acoplaron a kits de extracción de ADN comerciales. Para el desarrollo de la prueba LAMP se diseñaron primers específicos para la región ITS-1 optimizando las condiciones de la prueba para ejecutarlo a 60°C por 40 min. Para la evaluación de la precisión diagnóstica de LAMP, se utilizó un diseño de casos y controles colectando 139 muestras de heces de bovinos sacrificados en el “Frigorífico camal San Pedro” en Lurín-Perú. Las muestras se clasificaron como positivas y negativas usando la inspección hepática post mortem y la microscopía de huevos en bilis. LAMP optimizado con la técnica de extracción de ADN logró una sensibilidad del 87.8% (IC 95%: 80.4% - 93.2%) y especificidad del 100 % (IC 95%: 85.8% - 100%), con un likelihood ratio negativo de 0.12 (IC95: 0.08 - 0.19). Investigación 2: Estudio experimental donde se evaluó la eficacia trematicida de extractos de ajos in vitro. Estadios adultos de F. hepatica fueron incubados durante 48 h expuestos a 10 μg/ml de aceite esencial de ajo, 10 μg/ml de extracto acuoso de ajo y 15 μg/ml de triclabendazol sulfóxido usando 112 fasciolas por cada tratamiento. La eficacia se evaluó con el porcentaje de fasciolas totalmente paralizadas por cada grupo. Los adultos de F. hepatica incubados con triclabendazol sulfóxido (15 μg/ml) mostraron un mayor porcentaje de fasciolas paralizadas con respecto al extracto acuoso (16.9 vs 0 %; P<0.002) y aceite esencial (16.9 vs 4.5%; P<0.001). Adicionalmente, se hizo una evaluación de dosis-respuesta determinando que la concentración letal 50 (CL50) del aceite esencial de ajo fue de 0.066 mg/ml, mientras que el CL50 del extracto acuoso de ajo fue de 8.37 mg/ml, estas concentraciones no mostraron efectos citotóxicos. Se concluye que la técnica LAMP con la extracción optimizada de ADN es una prueba diagnóstica sensible y altamente específica para el diagnóstico de la fasciolosis bovina y que el extractos acuoso y aceite esencial de ajo a concentración de 10 μg/ml muestra una actividad fasciolicida in vitro inferior al triclabendazol sulfóxido a 15 μg/ml. No obstante, a mayores concentraciones, los extractos de ajos si evidencian actividad fasciolicida sin actividad citotóxica.