Comprehensive analysis of resistance to rifampicin in Mycobacterium tuberculosis: genomic, functional, and structural insights

• Autor: Vallejos Sanchez, Katherine Jaqueline
• Formato: tesis doctoral
• Fecha de Publicación: 2024
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/17151
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/17151
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Tuberculosis; Heteroresistance; PonA1; Penicillin Binding Protein; Rifampicin; ORBIT; Genetic Manipulation; Secretome; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.00; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.08

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sigue siendo uno de los patógenos más mortales a nivel mundial, a pesar de ser una enfermedad prevenible. La tuberculosis (TB) se trata con una combinación de cuatro medicamentos antituberculosos de primera línea: rifampicina (RIF), isoniacida, pirazinamida y etambutol, para cepas sensibles a los medicamentos. Entre estos, la RIF es uno de los agentes más potentes para controlar la enfermedad. Sin embargo, la resistencia a la RIF conlleva la aparición de casos de TB resistente a la RIF (RR-TB) o multidrogo resistente (MDR-TB). El mecanismo principal de resistencia implica mutaciones en el gen rpoB, que es responsable de aproximadamente el 95% de los casos. No obstante, todavía se están identificando otros mecanismos moleculares y condiciones que podrían contribuir a la propagación de las poblaciones RR-TB y MDR-TB. Esta investigación doctoral se centra inicialmente en un análisis retrospectivo de secuencias genómicas completas de aislados clínicos de pacientes con TB. A través del análisis bioinformático, se detectaron poblaciones heterorresistentes a la RIF y se confirmaron experimentalmente en un estudio piloto mediante la reactivación de los cultivos primarios. Se utilizaron ensayos clave como el método de proporciones en agar, el ensayo de punto final para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y el ensayo indirecto de susceptibilidad a los medicamentos por observación microscópica para la caracterización de las cepas. Además, por cada cultivo primario, se aislaron colonias crecidas en ausencia y presencia de RIF, seguidas de la determinación del CMI y el secuenciamiento del gen rpoB. Este enfoque confirmó que el secuenciamiento podía identificar con éxito poblaciones heterorresistentes específicas, destacando el papel crucial de un diagnóstico preciso para garantizar un tratamiento eficaz. En la segunda parte de la tesis, se realizó un estudio in silico e in vitro sobre las formas nativa y mutante de la proteína PonA1, una proteína de unión a penicilina que se hipotetiza por estar involucrada en los mecanismos de resistencia a la RIF. Las proteínas recombinantes nativa y mutantes se clonaron, expresaron en E. coli Rosetta y se caracterizaron biofísicamente. La afinidad entre PonA1 y la RIF se evaluó utilizando espectroscopía de resonancia magnética nuclear por diferencia de transferencia de saturación (STD-NMR). Además, se generó un knockout del gen MMAR_0069, homólogo de ponA1 en Mmar, mediante recombinación mediada por oligos seguida del direccionamiento de la integrasa BxB1 (por sus siglas en inglés ORBIT), con modificaciones en el plásmido de carga. Se realizaron ensayos de complementación introduciendo las formas nativa y mutante de ponA1 de Mtb en las cepas KO. En estas cepas complementadas se evaluaron la determinación de la CMI, los cambios morfológicos (longitud celular, ancho y grosor de la envoltura celular) y la viabilidad celular tras la exposición a la RIF. Finalmente, esta tesis presenta un proyecto colaborativo realizado durante mi estancia en el Centre de Biochimie Structurale, donde se desarrolló una herramienta bioinformática llamada SecretoMyc. Esta herramienta facilita la predicción de proteínas secretadas en Mtb y proporciona información sobre proteínas homólogas enM. bovis, M. smegmatis, Mmar, M. abscessus y M. avium en tres sistemas de secreción: SEC, TAT y T7SS. En conclusión, esta tesis aporta nuevas técnicas de manipulación genética para micobacterias y ofrece herramientas para el estudio y control de la TB.