Elaboración de constructos genéticos para la expresión soluble de FimH de Salmonella enterica serovar Typhimurium

• Autor: Cajachagua Pucuhuaranga, Cindy Lee
• Formato: tesis de grado
• Fecha de Publicación: 2018
• Institución: Universidad Ricardo Palma
• Repositorio: URP-Tesis
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.urp.edu.pe:20.500.14138/1676
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.14138/1676
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Salmonella enterica; Ingeniería genética; Adhesión bacteriana; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.00

Salmonella enterica serovar Typhimurium es una bacteria que frecuentemente produce infección en los seres humanos, siendo las aves y huevos infectados los principales vehículos de transmisión. Para lidiar con este problema es necesario el desarrollo de una vacuna eficiente para aves contra S. Typhimurium, el cual está relacionado con el conocimiento de la estructura tridimensional de todas las proteínas asociadas a la virulencia del patógeno, como FimH; una adhesina que permite la unión del patógeno a la célula huésped. El primer paso para resolver la estructura tridimensional de FimH de S. Typhimurium mediante cristalografía es la obtención de proteína soluble, por ello en el presente trabajo se realizó un análisis in silico de la secuencia protéica de FimH utilizando herramientas y programas bioinformáticos online con la finalidad de elaborar constructos genéticos de expresión in vitro que permitan obtener fragmentos proteicos de FimH solubles. Los resultados del análisis in silico postularon la idea de que FimH tiene dos dominios: un dominio de lectina (25-186aa) y un dominio de pilina (187-335aa), además se logró elaborar 3 constructos genéticos in vitro (pFimH25-335FL-DsF, pFimH187-335PD-DsF, pFimH25-186LD), el primer y segundo constructo (pFimH25-335FL-DsF, pFimH187-335PD-DsF) fueron de co-expresión y contenían las secuencias nucleotídicas de fimH25-335FL y fimH187-335PD respectivamente conjuntamente con la secuencia nucleotídica de dsF; y el tercer constructo (pFimH25-186LD) fue de expresión y contenía la secuencia nucleotídica de fimH25-186LD, las secuencias nucleotídicas de fimH25-335FL, fimH187-335PD y fimH25-186LD fueron confirmadas mediante secuenciamiento. Luego de los ensayos de expresión se determinó que todas las proteínas de interés (FimH25-335FL, FimH187-335PD y FimH25-186LD) se expresaban en las cepas BL21(DE3), TUNER, ARTIC y Rosetta, asimimo luego de los ensayos de solubilidad se logró obtener FimH25-186LD soluble en la cepa BL21(DE3)