Genómica y edición génica como herramientas moleculares para el mejoramiento de la cepa Aspergillus fumigatus LMB-35Aa

Descripción del Articulo

Universidad Nacional Agraria La Molina. Escuela de Posgrado. Doctorado en Ciencias e Ingeniería Biológicas
Detalles Bibliográficos
Autor: Benites Pariente, Jhonathan Stivins
Formato: tesis doctoral
Fecha de Publicación:2024
Institución:Universidad Nacional Agraria La Molina
Repositorio:UNALM-Institucional
Lenguaje:español
OAI Identifier:oai:repositorio.lamolina.edu.pe:20.500.12996/6861
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Nivel de acceso:acceso abierto
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spelling Villena Chávez, Gretty KatherinaSamolski Klein, Ilanitacae299b-f34c-4eed-9531-50464a9b8156-1Benites Pariente, Jhonathan Stivins2024-12-23T16:06:39Z2024-12-23T16:06:39Z2024https://hdl.handle.net/20.500.12996/6861Universidad Nacional Agraria La Molina. Escuela de Posgrado. Doctorado en Ciencias e Ingeniería BiológicasLa edición génica mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 en hongos filamentosos ha abierto un campo de estudio amplio debido a la simplicidad de su uso en la manipulación genética. El presente trabajo tuvo como objetivo implementar esta tecnología como prueba de concepto para el mejoramiento genético de la cepa A. fumigatus LMB-35Aa con el fin de incrementar su capacidad de producción de enzimas celulolíticas. Para cumplir este objetivo, se utilizaron técnicas microbiológicas, bioquímicas, genéticas y moleculares que permitieron encontrar las condiciones adecuadas de producción de celulasas en un sistema de fermentación por biopelículas, la identificación de los genes involucrados en la degradación de celulosa, la purificación y caracterización de una endoglucanasa, así como la elección de un sistema adecuado de edición génica. En este sentido, el presente documento detalla el crecimiento en biopelícula de la cepa LMB-35Aa a 28 °C por 72 h, utilizando carboximetilcelulosa (CMC) como fuente de carbono e inductor de la producción de celulasas. Bajo estas condiciones, se obtuvo títulos enzimáticos de 0.059 U/mg para celulasas totales (FPAsa), 0.197 U/mg para endoglucanasas y 0.108 U/mg para β-glucosidasas. Además, se identificaron 16 genes de celulasas putativos en el transcriptoma de la cepa LMB-35Aa; de los cuales, se lograron clonar en la bacteria E. coli las endoglucanasas Egl2, Egl3, Egl7 y Afu7g06150. De estas proteínas, la Afu7g06150 se logró expresar, purificar y finalmente determinar las condiciones óptimas de actividad a 50 °C y pH 3, con una actividad de 0.75 U/mg. Finalmente, se consiguió la edición del genoma de la cepa LMB 35Aa utilizando CRISPR/Cas9 para inserción (knock-in) de la endoglucanasa EglA de A. niger ATCC 10864 en la localización del gen pksP del genoma de la cepa LMB-35Aa. La cepa editada genéticamente presentó un incremento de un ~40 % en su actividad endoglucanasa respecto a la cepa silvestre. Los resultados presentados demuestran el éxito en la implementación de la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 en la cepa nativa A. fumigatus LMB-35Aa para la producción de una enzima celulolítica (EglA) en un sistema de biopelícula, así como el gran potencial de esta técnica para su utilización en diferentes estudios genéticos y biotecnológicos en cepas nativas.Gene editing by using CRISPR/Cas9 technology in filamentous fungi has opened a wide field of study due to the feasibility of its use in genetic manipulation. The main goal of this research was to implement this technology for the genetic improvement of the A. fumigatus LMB-35Aa strain to produce cellulolytic enzymes in a biofilm system. To reach this objective, microbiological, biochemical, genetic, and molecular techniques were carried out that allowed finding the appropriate conditions for cellulase production in a biofilm system, as well as the identification of genes involved in cellulose degradation, purification and characterization of an endoglucanase, and the recognition of a suitable gene editing system. In this regard, this document details the biofilm growth of the LMB-35Aa strain at 28 °C for 72 h, using Carboxymethylcellulose (CMC) as a carbon source and cellulase inducer. Under these conditions, enzymatic titers of 0.059 U/mg for total cellulases (FPAse), 0.197 U/mg for endoglucanases and 0.108 U/mg for β-glucosidases were obtained. In addition, 16 putative cellulases were identified in the transcriptome of LMB-35Aa strain; from these endoglucanases; Egl2, Egl3, Egl7 and Afu7g06150 were cloned into E. coli. Afu7g06150 was express, purify, and finally determine the optimal conditions of activity at 50 °C and pH 3 with an activity of 0.75 U/mg. Finally, genome edition of LMB-35Aa strain was achieved by using CRISPR/cas9 for knock-in eglA gene from A. niger ATCC 10864 at the location of the pksP gene in LMB-35Aa genome. The edited strain showed an increase of ~40% in its endoglucanase activity compared to the wild strain. The results show the successful implementation of CRISPR/Cas9 gene editing technology in the native strain A. fumigatus LMB-35Aa to produce a cellulolytic enzyme (EglA) in a biofilm system as well as the great potential of this technique for genome edition in different genetic and biotechnological research in native strains.application/pdfspaUniversidad Nacional Agraria La MolinaPEinfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/Aspergillus fumigatusPendienteGenómica y edición génica como herramientas moleculares para el mejoramiento de la cepa Aspergillus fumigatus LMB-35Aainfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionreponame:UNALM-Institucionalinstname:Universidad Nacional Agraria La Molinainstacron:UNALMSUNEDUCiencias e Ingeniería BiológicasUniversidad Nacional Agraria La Molina. Escuela de PosgradoDoctoris Philosophiae - Ciencias e Ingeniería Biológicas45226947https://orcid.org/0000-0001-8123-3559https://orcid.org/0000-0002-1883-77950975333510542748https://purl.org/pe-repo/renati/type#tesishttps://purl.org/pe-repo/renati/level#doctor511018Blas Sevillano, Raúl HumbertoKitazono Sugahara, Ana AkemiEspejo Joya, Rosa AmeliaRomero Suárez, DavidORIGINALbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdfbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdfTexto completoapplication/pdf5896516https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/9d0389c5-cb09-4f7f-aa0c-a6a15f3f3245/download2387530055dba7981e4fd962bac5df8eMD51Informe similitud Turnitin.pdfInforme similitud Turnitin.pdfInforme originalidadapplication/pdf7580188https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/837d8e5a-f905-40be-a8ce-11adebb86e3e/download7219decda69ea94db941d2607442aca2MD52Formato de REPOSITORIO.pdfFormato de REPOSITORIO.pdfAutorizaciónapplication/pdf7203626https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/a3a064f5-1d70-4ff6-94a1-c693d00d67b4/downloadbb1748a31ad730d0cdac9454bec4c944MD53LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81664https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/53428aab-421a-4dbf-8bba-27c6cc6a11da/download97c5bee00fbb4c4f8867bd742b579336MD54TEXTbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdf.txtbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdf.txtExtracted texttext/plain101493https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/718821c0-cf03-4705-b0c4-313df369b628/download95661b802a534228f832d0bc46a9a65fMD55Informe similitud Turnitin.pdf.txtInforme similitud Turnitin.pdf.txtExtracted texttext/plain101440https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/92842a61-85e7-4752-a32a-e0b5dfe1f7d2/download0d0f5c034521c38532bac409220182a8MD57Formato de REPOSITORIO.pdf.txtFormato de REPOSITORIO.pdf.txtExtracted texttext/plain2https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/8a45689e-ef6c-46aa-8810-d9fb4445df4a/downloade1c06d85ae7b8b032bef47e42e4c08f9MD59THUMBNAILbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdf.jpgbenites-pariente-jhonathan-stivins.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg4097https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/cdfbd6a0-37ab-442b-9c52-56e9b04f486c/download3e2a855fbc1e887d6bd260731687a4b6MD56Informe similitud Turnitin.pdf.jpgInforme similitud Turnitin.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg3947https://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstreams/df09f108-eb02-4b36-8404-4de194e7ebbe/download3713360deb5215913052cf964fc6d7e2MD5820.500.12996/6861oai:repositorio.lamolina.edu.pe:20.500.12996/68612024-12-23 22:15:14.872https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessopen.accesshttps://repositorio.lamolina.edu.peRepositorio Universidad Nacional Agraria La Molinadspace@lamolina.edu.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