Evaluación del límite de detección de heterorresistencia de Mycobacterium tuberculosis usando secuenciación nanopore con ADN genómico y amplicones a partir de mezclas bacterianas heterorresistentes en muestras de esputo negativo

• Autor: Ramos Lette, Diego Manuel
• Formato: tesis de maestría
• Fecha de Publicación: 2025
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/17996
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/17996
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Heterorresistencia; Mycobacterium Tuberculosis; Nanopore; Método de Proporciones; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03

La heterorresistencia (HR), es definida como la coexistencia de subpoblaciones bacterianas susceptibles y resistentes a un fármaco, representa un desafío clínico importante en el tratamiento de la tuberculosis (TB), ya que puede pasar desapercibida mediante métodos convencionales de cultivo. La HR puede originarse por coinfección con múltiples cepas de Mycobacterium tuberculosis (una susceptible y otra resistente) o por la aparición espontánea de mutantes resistentes dentro de una población susceptible. Tradicionalmente, el método de proporciones en agar considerado el gold standard para la detección de resistencia permite identificar cepas resistentes incluso cuando representan apenas el 1% de la población bacteriana. Sin embargo, su aplicación rutinaria es limitada debido al tiempo prolongado de incubación (2–3 semanas) y a la infraestructura especializada que requiere. Frente a estas limitaciones, la secuenciación genética, en particular mediante la plataforma portátil Nanopore, surge como una alternativa prometedora, ofreciendo resultados más rápidos y la posibilidad de realizar análisis genómicos y detección de mutaciones asociadas a resistencia. En este contexto, el presente estudio evaluó la capacidad de la secuenciación Nanopore para detectar HR en M. tuberculosis en comparación con el método de proporciones en agar. Para ello, se desarrolló un protocolo que combinó dos métodos de extracción de ADN (fenol-cloroformo purificado con perlas magnéticas y extracción mediante columnas de sílice), dos tipos de bibliotecas (Native Ligation y Rapid Barcoding), y dos tipos de material genético (ADN genómico y amplicones), utilizando muestras de esputo negativas enriquecidas con mezclas decepas susceptibles y resistentes en distintas proporciones. Los resultados indicaron que el método de extracción basado en fenol-cloroformo y purificación con AMPure XP beads produjo una cantidad y tamaño de fragmentos de ADN significativamente mayores que el método basado en columnas. Asimismo, la biblioteca Native Ligation proporcionó una mayor profundidad que la Rapid Barcoding, y el uso de amplicones permitió detectar mutaciones asociadas a subpoblaciones resistentes en comparación al ADN genómico donde no se pudo ni cubrir toda la secuencia de M. tuberculosis. En cuanto a los límites de detección, la secuenciación Nanopore permitió identificar HR cuando la cepa resistente representaba al menos ~10% de la población, mientras que el método de proporciones en agar detectó cepas resistentes desde el 1%. En conclusión, aunque la secuenciación Nanopore no sustituye completamente al método de proporciones debido a su límite de detección más alto, si permite conocer la mutación o mutaciones presentes en el gen asociado a la resistencia de manera rápida y práctica para el diagnóstico de TB HR, con el potencial de optimizar el manejo clínico de los pacientes y fortalecer la vigilancia epidemiológica.