Selección e identificación de aptámeros de ADN capaces de reconocer péptidos derivados de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis

• Autor: Poma Espinoza, Alexandra Victoria
• Formato: tesis de maestría
• Fecha de Publicación: 2023
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/13514
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/13514
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Aptámeros; Leishmania braziliensis; Péptidos; SELEX; ELONA; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.06; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.07; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.08

La Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) es una enfermedad parasitaria endémica de zonas tropicales que afecta a la piel y las mucosas, siendo Perú uno de los países que registra el mayor número de casos en América Latina. El protozoario Leishmania braziliensis es el principal agente etiológico de LTA. La detección es clave en el control de la enfermedad. Se reporta que el número de parásitos de Leishmania presentes en las lesiones es generalmente bajo, lo que reduce significativamente la sensibilidad de las pruebas de diagnóstico directas que consisten en la visualización del agente infeccioso mediante el microscopio. Asimismo, las herramientas de diagnóstico molecular de Leishmaniasis requieren una gran infraestructura, equipos y capacitación avanzada de personal. Por ende, el diagnóstico de laboratorio de Leishmaniasis sigue siendo un reto en las zonas endémicas rurales de mayor prevalencia de la enfermedad debido a que no cuentan con recursos e infraestructura necesarios. Este trabajo de investigación propone la selección e identificación de aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de L. braziliensis. Primero, se identificaron péptidos de membrana presentes en estadíos de promastigote y amastigote de Leishmania spp. mediante el análisis de datos reportados en la literatura y herramientas bioinformáticas. Los péptidos diana fueron empleados en la selección in vitro de aptámeros mediante el método SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) usando el kit X-Aptamers. Posteriormente, se identificaron los aptámeros candidatos mediante secuenciación y análisis bioinformático. Finalmente, se realizaron ensayos ELONA (ensayo de oligonucleótidos ligados a enzimas) para determinar la caracterización in vitro de los aptámeros candidatos. Se observó que las cinco secuencias seleccionadas como aptámeros candidatos presentaron afinidad in vitro para sus respectivas dianas (péptido 2 y péptido 3). Mediante la razón entre ensayos con el péptido diana (cognate) y un péptido no-diana (non-cognate), se determinó el mejor candidato por la especificidad y alta afinidad por su péptido diana. Se demostró que el sistema X-Aptamers permite la adecuada selección de aptámeros usando péptidos diana con un gran porcentaje de éxito, ya que todas las secuencias seleccionadas mostraron afinidad por las dianas. Del mismo modo, se concluye que la técnica ELONA permite una caracterización primaria de aptámeros. Estos resultados representan el primer paso hacia el desarrollo de un sistema de captura in vitro que permita el enriquecimiento celular de L. braziliensis en muestras biológicas o su detección mediante biosensores.