Epidemiología molecular de los genotipos de virulencia en cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes dispépticos peruanos

• Autor: Guzman Velasquez, Luis Jesus Junior
• Formato: tesis doctoral
• Fecha de Publicación: 2023
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/14822
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/14822
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Helicobacter pylori; Factores de Virulencia; Genoma Completo; Neoplasias Gástricas; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.07; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.02.19; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.02.21

Introducción: El adenocarcinoma gástrico se considera la séptima causa de muerte por malignidad en la región las Américas. A nivel nacional, la cancerización del tejido estomacal corresponde a la primera causa de mortalidad asociada con lesiones neoplásicas. Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno común en humanos y responsable de una variedad de enfermedades gastrointestinales como gastritis, ulcera gastroduodenal, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas y cáncer gástrico. La prevalencia de infección por H. pylori en Perú alcanza entre 45% a 83%, observándose que en los últimos 15 años no se ha modificado en los estratos socioeconómicos medio/alto y se ha incrementado en aquellas poblaciones con déficit socioeconómico y carencias de servicios de salud. Según la casuística del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN) el 89.6% de los casos con adenocarcinoma gástrico presentan la infección por el patógeno H. pylori. La interacción de factores de virulencia presentes en H. pylori promueven cambios moleculares sobre la mucosa epitelial gástrica que se traducen en lesiones de riesgo de desarrollo de cáncer y, es posible que, los tipos de lesiones precancerosas observadas entre pacientes con infección por H. Pylori en Perú se relacionen a marcadores moleculares de virulencia presentes en el genoma de las cepas de H pylori circulantes en nuestro medio, lo que permitiría identificar patrones de riesgo de lesiones gástricas graves entre pacientes con infección por H. pylori. Algunos genes relacionados a factores de virulencia de H. pylori se asocian con el incremento de riesgo de enfermedad neoplásica; tal como, el gen de la citotoxina vacuolizante A (vacA) que codifica para la secreción de la proteína toxigénica VacA, la citotoxina relacionada al gen A (cagA) que confiere una potente actividad proinflamatoria y mitogénica a H. pylori, el gen asociado a ulceración inducido por interacción con el epitelio (iceA) y el gen babA2, de adhesión a antígenos de grupo sanguíneo, que permiten la interacción del patógeno con la superficie de las células gástricas. Pero, los reportes de tipificación del gen cagA son aún insuficientes en nuestro medio y, la detección de genes de virulencia relacionados al gen iceA y al gen babA2, así como, la tipificación y sub-tipificación del gen vacA aún no se ha descrito. Por lo que resulta una necesidad no solo conocer la variabilidad y la distribución de las cepas virulentas de H. pylori en nuestro entorno sino también explorar de forma masiva características moleculares basadas en el viruloma y resistoma de los genomas completos de aislados de H. pylori y su impacto sobre los hallazgos histopatológicos de mucosa epitelial gástrica en pacientes infectados que presentan la lesiones precancerosas tipo metaplasia intestinal. Preguntas de investigación: 1) ¿La lesión precancerosa metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica está asociada a la detección convencional del genotipo cagA(+)/vacAs1am1 en las cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes dispépticos peruanos?; 2) ¿La lesión precancerosa metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica está asociada a la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 en el genoma completo de cepas aisladas de H. pylori determinada mediante tecnologías de secuenciación de última generación provenientes de pacientes dispépticos peruanos? Métodos: Los datos analizados provienen de un estudio primario conformado por una cohorte de 500 pacientes con dispepsia y cepas aisladas de H. pylori criopreservadas en el biobanco del Laboratorio Centinela de Helicobacter pylori del Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH), enrolados y colectados entre el año 2016 y 2017 en el Servicio de Gastroenterología del Hospital Cayetano Heredia. En la primera investigación, el diseño fue de tipo transversal y utilizo los registros de casos con dispepsia diagnosticados para la infección por H. pylori y sus aislados criopreservados correspondientes. Los aislados procedentes del criobanco fueron reactivados y se extrajo su ADN genómico. En las muestras, se amplificó el ADN de H. pylori mediante PCR convencional para la detección de factores de virulencia del patógeno. Se analizó la asociación entre los estados de enfermedad según gastritis crónica no atrófica y la presencia de lesiones precancerosas tipo metaplasia de los pacientes con infección por H. pylori frente al genotipo de virulencia cagA(+)/vacAs1am1, y mediante un modelo lineal generalizado con enlace log, distribución binomial y varianza robusta, se estimó la razón de prevalencias; también se analizó la asociación de la detección de los motivos EPIYA-A, EPIYA-B y EPIYA-C; los alelos s1, s2, i1, i2, d1, d2, m1, m2 y subtipos s1a, s1b y s1c del gen vacA, los alelos 1 y 2 del gen iceA y el gen babA2 frente al estado clínico de metaplasia intestinal de los casos en estudio. En la segunda investigación, de tipo exploratoria, se utilizó el reporte histopatológico de los casos con infección por H. pylori y sus cepas aisladas correspondientes. Las cepas aisladas fueron reactivadas, se extrajo y purifico el ADN genómico. Las muestras se secuenciaron mediante tecnologías de última generación y se obtuvo el genoma completo de los aislados. Se analizó la asociación entre la variante genética de virulencia EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 y la presencia de lesión precancerosa tipo metaplasia intestinal, se estimó la razón de prevalencias mediante un modelo lineal generalizado con enlace log, distribución binomial y varianza robusta; también se tipificó el viruloma y resistoma para los genes relacionados con citotoxinas, genes de adherencia, genes moduladores de respuesta inmune y genes de resistencia antibiótica. Resultados: En la primera investigación fueron incluidos 158 casos con dispepsia e infección por H. pylori, el 36.7% de los aislados presentó el genotipo cagA(+)/vacAs1am1 y el 38.6% de los pacientes presentó hallazgo histopatológico de metaplasia intestinal. Se encontró evidencia significativa que la prevalencia de aislados con genotipo cagA(+)/vacAs1am1 fue 67% mayor en los pacientes con metaplasia intestinal respecto a los pacientes con gastritis crónica no atrófica (RP: 1.67; IC95%: 1.13 a 2.45). Este resultado fue similar en el análisis multivariado luego de ajustar por sexo y edad (RP: 1.81; IC95%: 1.25 a 2.61; p<0.05). También se observó asociación significativa del genotipo de riesgo de la región variable del gen cagA (RP: 1.56; IC95%: 1.02 a 2.41; p<0.05), y de la región media (RPa: 2.22; IC95%: 1.01 a 4.99; p<0.05) y la región intermedia (RPa: 1.94; IC95%: 1.05 a 3.58; p<0.05) del gen vacA, frente al hallazgo histopatológico de metaplasia intestinal. En la segunda investigación se incluyeron 49 casos con síntomas de dispepsia que presentaron infección por H. pylori, el 12.2% de los genomas completos secuenciados correspondió a la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 y el 57.1% de los casos presentó diagnóstico histopatológico de metaplasia intestinal. Se observó que la prevalencia de la variante genética de virulencia fue 77% mayor en pacientes con metaplasia intestinal respecto a los casos con gastritis crónica no atrófica, el hallazgo fue significativo (RPa: 1.77; IC95%: 1.13 a 2.77; p<0.05). Se observó que los genes de adhesinas babB/hopT (RPa: 1.19; IC95%: 0.70 a 2.04), hopZ (RPa: 1.49; IC95%: 0.87 a 2.56) y sabB/hopO (RPa:1.41; IC95%: 0.91 a 2.17) fueron prevalentes entre los casos con metaplasia intestinal, pero la evidencia no fue estadísticamente significativa. También hubo evidencia significativa que la prevalencia de aislados de H. pylori resistentes a macrólidos fue 92% mayor en pacientes con metaplasia intestinal respecto a los casos con gastritis crónica no atrófica (RPa: 192; IC95%: 1.24 a 3.11; p<0.05). Conclusiones: Se logró tipificar por PCR convencional los factores de virulencia de aislados de H. pylori procedentes de pacientes con síntomas de dispepsia, y se encontró evidencia que el genotipo cagA(+)/vacAs1am1 presenta un efecto de riesgo en el desarrollo de metaplasia intestinal entre pacientes con dispepsia que presentan la infección por H. pylori. Las repeticiones del motivo EPIYA-C en la región variable del gen cagA se asocian a lesiones precancerosas en los pacientes peruanos con dispepsia, y los polimorfismo virulentos en el gen vacA muestran un efecto de riesgo en el desarrollo de lesiones graves sobre la mucosa epitelial gástrica, sin embargo estos polimorfismos no mostraron una asociación significativa a excepción de las variantes m1 e i1 del gen. Además, se logró secuenciar y obtener genomas completos de calidad de los aislados de H. pylori mediante técnicas de secuenciación de última generación, fue posible tipificar un mayor número de factores de virulencia y determinar variantes genéticas para la integridad del gen cagA y el gen vacA. Hubo evidencia de que la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 se relaciona a la lesión precancerosa, y que la frecuencia de estos aislados fue predominante entre los diagnósticos histopatológicos de metaplasia intestinal. Se logró tipificar el resistoma de los asilados de H. pylori y permitió caracterizar a las cepas circulantes como microorganismos resistentes a fármacos macrólidos y quinolonas. En adición, al considerar limitaciones al explorar la relación genotipo – fenotipo la viabilidad de las cepas aisladas de H. pylori es un factor crucial dado que la bacteria es un microrganismo fastidioso de crecimiento lento que emplea un cultivo microbiológico nutricionalmente exigente, que en muestras provenientes de un biobanco compromete su capacidad de reactivación y/o obtención de densidad suficiente para estudios moleculares, no afectando a las técnicas moleculares convencionales de genotipificación de regiones cortas de genes pero si afectando la calidad de secuencias con mayor cobertura aplicados al estudio del genoma completo del microorganismo. Finalmente, ambos estudios aportan evidencias importantes del riesgo de la presencia de factores moleculares de virulencia presentes en las cepas aisladas de H. pylori circulantes en nuestro medio y su relación con las lesiones severas de tipo metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica de pacientes peruanos con síntomas de dispepsia, y se sugiere que ambos tópicos continúen estudiándose a fin de disponer información de utilidad terapéutica y reducir los casos de cáncer gástrico en nuestra población.