Detección molecular de Leishmania spp. subgénero Viannia basada en el sistema CRISPR-Cas12a utilizando como biomarcador el ADN de minicírculos del kinetoplasto (ADNk)

• Autor: Dueñas Villavicencio, Eva Andrea
• Formato: tesis de maestría
• Fecha de Publicación: 2022
• Institución: Universidad Peruana Cayetano Heredia
• Repositorio: UPCH-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorio.upch.edu.pe:20.500.12866/13026
• Enlace del recurso: https://hdl.handle.net/20.500.12866/13026
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Leishmaniasis Cutánea; Leishmania (Viannia) spp.; ADNk del Minicírculo; CRISPR-Cas12a; Detección Molecular; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03; https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#3.03.06

La Leishmaniasis tegumentaria americana es una enfermedad infecciosa endémica presente en 19 departamentos del Perú. Leishmania (Viannia) braziliensis es el principal agente etiológico de esta enfermedad en las Américas. La presentación clínica más frecuente es la Leishmaniasis cutánea que provoca lesiones cutáneas ulceradas. La confirmación del diagnóstico presuntivo clínico se basa en la realización de más de una prueba de laboratorio, que puede ser de tipo parasitológica, inmunológica o molecular. Existen diferencias en el grado de sensibilidad y especificidad de estas pruebas, además de que requieren tiempos largos de procesamiento y tienen un costo alto. Recientemente se han desarrollado pruebas de detección molecular de agentes patógenos altamente específicas y sensibles empleando la herramienta CRISPR/Cas donde destaca el sistema CRISPR-Cas12a. En el presente estudio se desarrolló y evaluó un método nuevo de detección molecular de Leishmania (Viannia) spp. basado en el sistema CRISPR-Cas12a en combinación con un paso previo de amplificación por PCR convencional empleando como biomarcador multicopia al ADN de minicírculos del kinetoplasto (ADNk). En la evaluación de la sensibilidad analítica de la prueba PCR/CRISPRADNk el límite inferior de detección fue de 0.05 equivalentes genómicos de parásitos (4.25 fg de ADN) (n=3), lo que constituye un valor con relevancia clínica. Además, la prueba de especificidad mostró que las cepas de referencia representativas de L.(Viannia) spp. generaron una señal distintiva con un promedio del valor de la razón de fluorescencia (ésto es, señal fluorescente de la muestra problema normalizada por la señal fluorescente del blanco de reacción) de 2.287 ± 0.29 en comparación al valor de 0.967 ± 0.08 del grupo de cepas del subgénero L.(Leishmania) a los 20 minutos de la reacción CRISPR (n=4). La diferencia en los valores de la razón de fluorescencia en los grupos evaluados fue estadísticamente significativa (p<0,001; prueba t para datos no pareados). No hubo reacción cruzada con ADN genómico humano ni con ADN de la cepa Y de Trypanosoma cruzi. La prueba PCR/CRISPR-ADNk desarrollada se evaluó en un panel de 49 muestras clínicas. Utilizando como punto de corte el criterio de la ‘media de los valores de la razón de fluorescencia de muestras negativas más 3 desviaciones estándar’ (cutoff =1.151), el 79.6% (39/49) de las muestras resultaron positivas y el 20.4% (10/49) resultaron negativas a detección de ADNk de Leishmania. Se consideró un segundo método de clasificación basado en el porcentaje de positividad (PP) de cada muestra (en relación a un control positivo) a partir de la data de señal fluorescente de la reacción Cas12a y un análisis estadístico para seleccionar el punto de corte de probabilidad óptimo para la clasificación que maximice el índice de Youden; este análisis resultó en la misma clasificación de resultados positivos (n=39; PP>29.995%) y negativos (n=10; PP ≤ 29.995%) que el punto de corte de media + 3DE. Ambos análisis catalogaron a las muestras clínicas con concordancia perfecta comparado con PCR en tiempo real (qPCR-ADNk) empleada como prueba de referencia: se obtuvo 100.0% de concordancia positiva (IC 95%: 91.0-100.0) y 100.0% de concordancia negativa (IC 95%: 72.2-100.0). Se demostró el potencial de la prueba PCR/CRISPR-ADNk como método nuevo de detección molecular de especies de Leishmania (Viannia) de importancia médica en Latinoamérica.