S13 y L33 como proteínas sensoras de movimientos de las subunidades ribosomales durante la iniciación de la síntesis proteica en bacterias

• Autores: Cuestas Quiroz, Flavia Alejandra, Sánchez Ato, Luis Andrés
• Formato: tesis de grado
• Fecha de Publicación: 2018
• Institución: Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas
• Repositorio: UPC-Institucional
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:repositorioacademico.upc.edu.pe:10757/622881
• Enlace del recurso: http://hdl.handle.net/10757/622881
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: Proteínas Ribosómicas; Antibacteriano; Biosíntesis de proteínas; Transferencia Resonante de Energía de Fluorescencia; Medicina

Las proteínas ribosomales S13 y L33 pertenecen respectivamente a las subunidades 30S y 50S del ribosoma bacteriano. S13 se posiciona en cercanía a los factores de iniciación (IF1 e IF3). L33 se encuentra opuesta a S13 en la subunidad mayor. El presente estudio, busca evaluar las proteínas S13 y L33 marcadas fluorescentemente durante la iniciación de la síntesis proteica, para generar un sistema experimental que permita analizar cambios estructurales en las subunidades ribosomales, especialmente durante la iniciación de la traducción y en función de la unión de antibióticos. Mediante técnicas recombinantes y cromatografía de intercambio iónico, se expresaron y purificaron ambas proteínas ribosomales. Se obtuvieron rendimientos de la producción de proteína L33 en el rango de miligramos por g de Escherichia coli, e índices de pureza sobre el 98%. S13 fue producido de manera similar y se obtuvieron proteínas puras en el rango de miligramos por g de Escherichia coli con una pureza de 99%. Ambas proteínas ribosomales fueron modificadas con compuestos fluorescentes compatibles con mediciones de FRET (De sus siglas en inglés, Föester Resonance Energy Transfer). En condiciones controladas S13 logró insertarse en la subunidad 30S, mientras que experimentos de sedimentación indicaron que L33 fluorescente no se unía a la subunidad 50S. Se realizaron mediciones FRET entre la subunidad 30S modificada con S13 fluorescente y los factores de iniciación IF1 e IF3. La medición FRET entre S13(Atto-540Q) e IF3-CTD(Atto-488) se utilizó para medir la interacción de estreptomicina, espectinomicina y GE81112, antibióticos que se unen a la subunidad menor del ribosoma. Estreptomicina se une rápidamente a la subunidad 30S y ocasiona un acercamiento de S13(Atto-540Q) al IF3-CTD(Atto-488) mientras que GE81112, y en menor medida espectinomicina, promueven un alejamiento de la proteína ribosomal del factor de iniciación. Ambos movimientos son compatibles con rotaciones de la cabeza de la subunidad 30S, previamente descritos como fundamentales para el funcionamiento del ribosoma. El presente estudio de investigación brinda un sistema experimental novedoso para estudiar cambios estructurales en la subunidad menor en función de la unión de antibióticos al ribosoma.