Evaluación de Cuatro Tiempos de Cultivo sobre la Tasa de Maduración y División Post-Fecundación in vitro de Ovocitos de Alpaca

• Autores: Huanca L., Wilfredo, Condori P., Rosario, Chileno M., María, García H., Pedro, Cainzo C., Juan, Becerra G., Juan J.
• Formato: artículo
• Fecha de Publicación: 2014
• Institución: Universidad Nacional Mayor de San Marcos
• Repositorio: Revista UNMSM - Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:ojs.csi.unmsm:article/10782
• Enlace del recurso: https://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/veterinaria/article/view/10782
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: in vitro fertilization; oocytes; maturation; alpaca; fecundación in vitro; ovocitos; maduración; alpacas

Se evaluó el efecto del tiempo de cultivo sobre la tasa de maduración nuclear y tasa de división post-fecundación a 72 horas de ovocitos de alpacas. Complejos Cumulus-Ovocitos (CCOs) fueron obtenidos de ovarios procedentes de animales beneficiados en el camal y transportados a 35 °C en solución salina 0.9% suplementada con antibiótico antimicótico. Los CCOs fueron aspirados de folículos de 2 a 6 mm. Experimento 1: 502 ovocitos fueron distribuidos en cuatro tiempos de maduración (30, 34, 38 y 42 horas) y madurados en TCM-199 suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB), 0.5 µg/mL de FSH, 10 µg/mL de hCG, 0.2 mM de piruvato de sodio, 50 µg/mL de gentamicina y 1 µg/mL de E2, y cultivados a 39 ºC bajo una atmósfera de 5% de CO2 y alta humedad. Posteriormente, los ovocitos fueron removidos, lavados con PBS suplementado con 10% de SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa y fijados en solución de etanol y ácido acético (3:1). Los ovocitos fueron colocados en portaobjetos, teñidos con 1% de orceína y examinados bajo un microscopio a 400x para determinar la maduración nuclear. Experimento 2: 533 ovocitos fueron cultivados bajo las mismas condiciones del experimento 1 y fecundados con espermatozoides obtenidos de epidídimos. Los espermatozoides fueron centrifugados a 700 g en una gradiente de Percoll discontinua (22.5:45%) por 25 minutos. El sobrenadante fue removido y el pellet (con espermatozoides viables) reconstituido con TL-Stock. Los gametos fueron co-cultivados por 18 horas a 39 ºC con 5% de CO2 en KSOM suplementado con 10% de SFB, 2 mM de piruvato de sodio y 50 µg/mL gentamicina, y evaluados a las 72 horas. En el Experimento 1 se obtuvo el 26.3±5.4, 52.6±6.7, 68.5±10.6 y 75.3±11.9% de ovocitos en Metafase-II para 30, 34, 38 y 42 h de cultivo, respectivamente, con diferencia estadística entre 30 y 34 h respecto a 38 y 42 h (p<0.05). En el Experimento 2, la tasa de división fue 9.5±4.8, 8.1±5.8, 15.6±9.2 y 19.8±8.0% para 30, 34, 38 y 42 h, sin diferencia estadística entre grupos. Los resultados sugieren que los ovocitos de alpacas requieren 38 a 42 h de maduración para obtener estadios de Metafase-II.
The study was carried out to evaluate the effect of incubation time on nuclear maturation and cleavage rate of alpaca oocytes after 72 hours post-fertilization. Cumulusoocyte complexes (CCOs) were collected from ovaries collected at slaughterhouse and transported in saline solution 0.9% with antibiotic antimycotic at 35 ºC. CCOs were aspirated from 2-6 mm follicles. Experiment 1: 502 oocytes were distributed in four maturation times (30, 34, 38, 42 hours), matured in TCM-199 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (v:v), 0.5 μg/mL FSH, 10 μg/mL hCG, 0.2 mM sodium pyruvate, 50 μg/mL gentamicine and 1 μg/mL oestradiol, and cultivated at 39 ºC in an atmosphere of 5% CO2 and high humidity. After maturation, CCOs were removed from maturation medium and washed with PBS supplemented with 10% FCS and 1 mg/ml of hyaluronidase, and fixed in ethanol and acetic acid (3:1). Oocytes were placed on a glass slide, stained with 1% orcein and examined under microscope at 400x to evaluate nuclear maturation status. Experiment 2: 533 CCOs were culture under similar maturation protocols than experiment 1 and fertilized with epididymal spermatozoa. These were obtained by centrifugation at 700 g on a Percoll discontinuous gradient (22.5:45%) for 25 min. The supernatant was removed by aspiration and the pellet (containing viable spermatozoa) was re-suspended in TL Stock. Gametes were co-incubated for 18 h at 39 °C with 5% CO2 and cultivated in KSOM supplemented with 10% FCS (v:v), 0.2 mM sodium pyruvate and 50 μg/ml gentamicine, and evaluated in 72 hours. In experiment 1, 26.3±5.4, 52.6±6.7, 68.5±10.6 and 75.3±11.9% of oocytes were in M-II stage for the 30, 34, 38, and 42 h of culture respectively, with significant difference between 30 and 34 with respect to 38 and 42 h (p<0.05). In experiment 2, the cleavage rate was 9.5±4.8, 8.1±5.8, 15.6±9.2 and 19.8±8.0% for 30, 34, 38, and 42 h after culture, and without statistical difference between groups. These results indicate that is required 38-42 h for the maturation of alpaca oocytes.