Capacidad de Dos Líneas Celulares para la Producción de Embriones Clonados mediante Transferencia Nuclear de Células Somáticas

• Autores: Cortez, Jenin, Murga, Nilton, Segura, Gleni, Rodríguez, Lleretny, Vásquez, Héctor, Maicelo-Quintana, Jorge
• Formato: artículo
• Fecha de Publicación: 2017
• Institución: Universidad Nacional Mayor de San Marcos
• Repositorio: Revista UNMSM - Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú
• Lenguaje: español
• OAI Identifier: oai:ojs.csi.unmsm:article/13878
• Enlace del recurso: https://revistasinvestigacion.unmsm.edu.pe/index.php/veterinaria/article/view/13878
• Nivel de acceso: acceso abierto
• Materia: assisted reproductive technology; bovine; cloning; somatic cell nuclear transfer; handmade cloning; reproducción asistida; bovino; clonación; transferencia nuclear de células somáticas; clonación hecha a mano

En este estudio se demuestra el uso de la transferencia nuclear de células somáticas para producir los primeros bovinos clonados en el Perú. Se obtuvieron fibroblastos de piel y células de cúmulos de donantes adultos para ser usados como carioplastos; asimismo, ovocitos obtenidos a partir de ovarios de camal fueron madurados in vitro por 24 h. Los ovocitos madurados se incubaron 2 h en demecolcina (2.5 ìg/ml) para promover la formación del cono con el plato metafásico y para orientar la enucleación manual. Se eliminó la zona pelúcida en pronasa (2 mg/ml) por 3 min. La enucleación fue manual con una microcuchilla dividiendo el óvulo en dos mitades, donde las mitades carentes de núcleo fueron fusionadas por el método «sandwich» (citoplasto–fibroblasto–citoplasto) por electrofusión. Las estructuras reconstruidas se activaron químicamente mediante incubación por 5 min en 7% de etanol absoluto, seguido por 5 h de citocalacina B (5 ìg/ml) y cicloheximida (10 ìg/ml). Las estructuras se cultivaron durante 7 d hasta la fase de incubación/eclosión de blastocisto. Siete blastocistos fueron transferidos a seis vacas receptoras sincronizadas siete días después de la ovulación. Se logró la permanencia de cuatro y tres vesículas embrionarias hasta los días 28 y 60, respectivamente. Dos terneras llegaron a nacer a partir de embriones reconstruidos con células de piel y con células de cúmulos. Mediante el análisis de genotipos, utilizando 15 marcadores (SSR) para bovinos, se confirmó que los terneros clonados fueron derivados de las líneas celulares de las donantes.
This study demonstrates the use of nuclear somatic cell transfer to produce the first cloned cattle in Peru. Skin fibroblasts and cumulus cells from adult donors were obtained for use as carioplasts; likewise, oocytes obtained from ovaries in the slaughterhouse were matured in vitro for 24 h. The mature oocytes were incubated 2 h in demecolcin (2.5 μg/ml) to promote cone formation with the metaphase plate and to guide manual enucleation. The zona pellucida in pronase (2 mg/ml) was removed for 3 min. The enucleation was manual with a microblade dividing the ova into two halves, where the nucleus-lacking halves were fused by the «sandwich» method (cytoplast–fibroblast– cytoplast). The reconstructed structures were chemically activated by incubation for 5 min in 7% absolute ethanol, followed by 5 h of cytochalacin B (5 μg/ml) and cycloheximide (10 μg/ml). The structures were cultured for 7 d until the blastocyst incubation/hatching phase. Seven blastocysts were transferred to six synchronized recipient cows seven days after ovulation. The permanence of four and three embryonic vesicles was achieved until days 28 and 60, respectively. Two calves were born from embryos reconstructed with skin cells and cumulus cells. By the genotype analysis using 15 markers (SSR) for cattle, it was confirmed that cloned calves were derived from donor cell lines.