Identificación y evaluación del mecanismo de activación del sistema proacrosina/acrosina en espermatozoides de alpaca (vicugna pacos) - Rodriguez Llanos, Claudia Violeta (2012)
La reacción del acrosoma (RA), es un evento previo a la penetración de la zona pelúcida (ZP) y fusión de membranas durante la fecundación, está gobernado por la activación de proteasas, en especial por el sistema proacrosina/acrosina en mamíferos. La presencia de este sistema ya ha sido previamente descrito en espermatozoides de alpaca por Valdivia et al. (2000); sin embargo, hasta la fecha se desconoce qué sistema de proteasas gobierna la RA en espermatozoides de alpaca ya que recientes estudios en espermatozoides humanos, caninos y bovinos han demostrado que enzimas con actividad tipo tripsina y quimotripsina gobiernan la RA. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de diferentes inhibidores de enzimas tipo tripsina y quimotripsina sobre la RA y la actividad proteolítica en espermatozoides de alpaca, con la finalidad de conocer qué sistema enzimático gobierna al espermatozoide de alpaca. Se evaluó el efecto de tres inhibidores de enzimas semejantes a tripsina: Benzamidina (2, 4 y 6mM), Inhibidor de tripsina de frejol de soya (SBTI) (20, 40 y 60µM), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (0.6, 0.8 y 1mM); y de un inhibidor de enzimas semejantes a quimotripsina: tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) (0.25, 0.5 y 1µM). Se encontró que la RA y la actividad proteolítica fue más eficientemente inhibida por benzamidina (4mM) y PMSF (0.6mM), cuando estos fueron añadidos 10 minutos antes de la inducción de la reacción del acrosoma por lisofosfatidilcolina. TPCK no tuvo efecto alguno sobre la RA o la actividad proteolítica individual. Al evaluar los extractos ácidos (EAs) de espermatozoides de alpaca a pH3 en geles de actividad, se observó una gran banda de digestión de 55KDa, que corresponde a proacrosina. Los EAs fueron posteriormente activados con el incremento del pH 3 a pH 8. La activación del sistema proacrosina/acrosina fue evaluada a los 15, 30 minutos, 1, 1.5 y 2 horas de activación en geles de actividad. Se observaron tres bandas de digestión: de 55 KDa que corresponde a la proenzima proacrosina, una banda de 47 KDa que corresponde a α- acrosina y una banda de 39 KDa que corresponde a β-acrosina. Este ensayo reveló que a los 15 minutos el sistema proacrosina/acrosina está activo y que a la hora y media de activación la proenzima está completamente activada. La fusión de membranas acrosomales, la dispersión del contenido acrosomal y la actividad proteolítica de espermatozoide de alpaca está gobernada por el sistema enzimático tipo trispina proacrosina/acrosina. Palabras clave: actividad proteolítica, reacción del acrosoma, inhibidores tipo tripsina, inhibidores tipo quimotripsina, acrosina.