Selección y validación de genes endógenos normalizadores de la expresión de genes de interés a partir de transcriptomas de estadios tempranos del desarrollo de Paralichthys adspersus - Guarnizo Bejarano, Paul Orlando (2021)
El lenguado fino Paralichthys adspersus, de alto valor comercial por su cotizada carne, afronta diferentes problemas durante las primeras etapas de su desarrollo relacionados a malformaciones y altas tasas de mortalidad; por lo que la aplicación de técnicas moleculares para la mejora en su cultivo resulta importante a fin de satisfacer su gran demanda. En este sentido, el trabajo buscó seleccionar y validar genes endógenos para la normalización de genes de interés en los primeros estadios de desarrollo de P. adspersus. Estos genes han sido identificados en datos de transcriptomas y seleccionados considerando valores de expresión diferencial in silico. Así, se evaluaron cinco genes candidatos a endógenos, como codificantes de la proteína ribosomal 40S S4 (RPS4/40S-RP), proteína ribosomal 60S P2 (RPP2/60S-RP), factor de elongación alfa 1a1 (EEF1A1), proteína ribosomal 40S S30 (FAU) y b-actina (bAct); y cinco genes relacionados al desarrollo como, la proteína parecida a formina 1 (Form1) y forkhead box protein B1 (Foxb1) y al crecimiento BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like (BCL2), Osteocalcina (Osteo) y proteína 5 de unión al factor de crecimiento parecido a insulina (IGFbp5). Se diseñaron cebadores específicos para siete genes, excepto FAU, bAct e IGFbp5. Los análisis de validación se realizaron utilizando cDNAs obtenidos de ejemplares de 20, 40, 60 y 90 dpe (n=10 por estadío). Las evaluaciones de eficiencias de amplificación de cada marcador se realizaron para todos los genes. Los valores Ct analizados utilizando tres algoritmos estadísticos (geNorm, NormFinder y Bestkeeper) permitieron calcular la estabilidad de cada gen, donde la combinación de 40S-RP + 60S-RP + bAct resultó ser la más estable. El perfil de los genes relacionados al desarrollo (Form1 y Foxb1) mostró una sobreexpresión en el grupo pre metamórfico (20 dpe), opuesta a los relacionados al crecimiento (BCL2, IGFbp5, Osteo) quienes se sobreexpresaron durante y luego de la metamorfosis (40, 60 y 90 dpe). Los perfiles de expresión de ciertos genes de interés cambiaron significativamente (p valor < 0.05) al ormalizarlos con genes inestables (FAU + EEF1A1). Finalmente, los genes evaluados son los primeros marcadores reportados para P. adspersus resultando potenciales para ser utilizados su monitoreo durante estadios tempranos.