Estandarización de una PCR multiplex en tiempo real para el diagnóstico de leptospirosis y malaria - Lozano Untiveros, Katherine (2023)
Varias de las enfermedades con etiología infecciosa causada por una variedad de patógenos cursan inicialmente con síndrome febril agudo (SFA) y han sido reconocidos como un grupo importante de enfermedades que es difícil de diferenciar debido a su similitud en los síntomas. Los SFA como malaria producida por P. falciparum, malaria producida por P. vivax y leptospirosis deben ser consideradas como sospecha principal en áreas tropicales debido a la alta prevalencia y mortalidad. Los índices de letalidad debido a la falta de un diagnóstico oportuno son altos entre los pacientes con malaria por P. falciparum y leptospirosis. Se han reportado problemas en el diagnóstico de malaria debido al desarrollo de infecciones con bajo nivel de parasitemia. Además, se ha reportado problemas en la detección de infecciones mixtas de malaria y no detección de coinfecciones de malaria y leptospirosis. Así, la OMS ha recomendado el desarrollo de un método qPCR-Multiplex para identificar simultáneamente y en una sola reacción diferentes patógenos. La presente investigación, diseñó y estandarizó una PCR Multiplex en tiempo real denominado “qPCR-Multiplex FVL”, capaz de identificar simultáneamente P.falciparum, P.vivax y Leptospira spp. Se diseñaron cebadores y sondas para identificar simultáneamente infecciones con bajo nivel de parasitemia usando secuencias subteloméricas de múltiples copias, Pfr364 para P.falciparum, Pvr47 para P.vivax y el gen Rrs (16S ARNr) para identificar Leptospira spp. El “qPCR-Multiplex FVL” amplificó simultáneamente con éxito las tres dianas Pfr364, Pvr47 y Rrs, manteniendo su eficiencia de amplificación a pesar del formato de multiplexación. El análisis de regresión con la construcción de curvas estándares mostró valores de eficiencia de amplificación de 93 % para Pfr364, 106 % para Pvr47 y 103 % para Rrs con valores de R² > 0,997. Además, mostró un límite de detección altamente sensible adecuado para identificar niveles tan bajos como 0.46 copias de Pfr364 para P.falciparum, 0.06 copias de Pvr47 para P.vivax y 0.63 copias de Rrs para Leptospira spp. No se encontró reacción cruzada con otros microorganismos relacionados a ambos tipos de patógeno. La presente investigación diseñó y desarrolló una plataforma de “qPCR-Multiplex FVL” eficaz para el diagnóstico de infecciones simples y coinfecciones de malaria y leptospirosis, con el potencial de identificar simultáneamente infecciones de baja densidad parasitaria.