INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS BIOLÓGICAS Células madre y Ecotoxicología - Iannacone Oliver, José (2018)
El objetivo de esta investigación fue evaluar las diferentes concentraciones del plasma rico en plaquetas 0%, 1% y 10% en el cultivo in vitro de células madre derivada de adipocitos equinos. Como materiales y métodos se utilizaron un total de 20 muestras de tejido adiposo, las que fueron extraídas de equinos beneficiados en el camal Casablanca - Pachacamac - Lima, Perú y trasportados al laboratorio. La muestra fueron lavadas 3 veces en buffer PBS suplementado con antibióticos, eliminando los excedentes de sangre y otras impurezas, al término este tejido fue cortado en pedazos. Estos pedazos fueron colocados en colágenasa tipo I (5mg·mL-1) en medio DMEM, por 15 min en baño maría a 37°C. Los pedazos que no fueron digeridos fueron retirados y el sobrenadante fue tamizado en 70um. Posteriormente se diluyó una proporción 1:1 en medio DMEM +10% FBS centrifugándolo a 1000 rpm por 10 minutos. El pellet obtenido fue diluido nuevamente con 3 ml de DMEM + 10% FBS y centrifugado nuevamente, con la finalidad de lavarlo al final de este proceso se obtuvo un volumen final de 0,5 mL. Con la finalidad de observar la viabilidad de las células, estás fueron colocadas con Azul de Tripán al 0,04 % y contadas en cámara de Neubauer. Para el cultivo celular se utilizó el medio DMEM bajo en glucosa y suplementado con 10% de suero fetal bovino a una concentración 10 000 cel·cm-2 en un flask de 25 cm2, a las 48 h pos cultivo se retiró el medio, descartando el sobrenadante y eliminando así a las células no adherentes. Los cambios de medio fueron realizados cada 3 días pos cultivo cuando este alcanzaba un 80% de confluencia de crecimiento, realizándose como máximo de 3 pasajes por muestra. Las células fueron sometidas a Tripsina-EDTA 0.25% y posteriormente criopreservadas en crio viales sumergidas en nitrógeno líquido hasta su posterior uso en FBS al 90% suplementado con 10% de DMSO en una dilución 1:1. Para la caracterización molecular, se tomaron en cuenta aquellas células que presentaba una morfología típica en forma fusiforme, de núcleo elongado y adherente a la placa de cultivo característica típica de las células madres mesénquimales. Se evaluaron dos grupos de genes, el primer grupo de genes marcadores que se evaluó son los de superficie de las células mesenquimales con los genes denominados clúster de diferenciación CD29, CD34, CD44, CD90 y el complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II (MHCII). El segundo grupo fue de genes marcadores de pluripotencia denominados factores de transcripción (Nanog y Oct4). Para el plasma rico en plaquetas, se utilizaron 6 caballos del Hospital Veterinario del Ejercito del Perú, a las que se le obtuvo 50 mL sangre, extraído de la zona yugular y colocados en tubos pre tratados en citrato de sodio. Como resultados se aisló e identificó las células madre a partir de tejido adipocitario usando marcadores genéticos de superficies y pluripotencialidad (CD29, CD34, CD44, CD90, MHCII, Nanog, Oct4). Con respecto a los marcadores de pluripotencialidad solo una muestra presentó positividad para NANOG y OCT4 Con respecto a la obtención del plasma rico en plaquetas, solo cuatro caballos, presentaron un rendimiento óptimo para la experimentación, teniendo como valor promedio 60% de plaquetas con respecto al número de plaquetas en sangre total los que fueron seleccionados para el enriquecimiento del medio del cultivo. En conclusión, es posible obtener células madres del tejido adiposo de animales beneficiados, además de poder ser utilizadas en futuras terapias celular.