Estandarización e implementación de una técnica de qPCR para la detección de Leptospira sp. patógenas en muestras de orina de caninos domésticos - Sedano Sánchez, André Felipe (2014)
La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de importancia mundial en salud pública. La enfermedad en humanos está asociada a la presencia de la bacteria Leptospira spp. en los animales, en las zonas urbanas los animales domésticos como el perro juegan un rol importante en la transmisión de la enfermedad. Los caninos domésticos pueden desarrollar la enfermedad o ser portadores asintomáticos que eliminan la bacteria en grandes cantidades en la orina. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar e implementar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en muestras de orina de caninos domésticos infectadas experimentalmente con cepas patrón de Leptospira spp. Las muestras de orina fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación (MAT). Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira spp., y una sonda TaqMan Lepto probe, que amplifican e hibridan respectivamente una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60°C por 1 minuto. Los valores de Ct determinados durante la estandarización de la PCR, estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira spp., las cepas saprófitas y otros géneros bacterianos no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 10² con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R²) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 10⁷ leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 10² leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87. Palabras claves: caninos domésticos, PCR en tiempo real, sondas TaqMan, Leptospira spp., Leptospirosis, orina