Expresión, caracterización bioquímica y determinación de actividad fibrinolítica de la proteína recombinante FhT (rFhT) - Buiza Urdanivia, Yerson Jahel (2024)
La proteína FhT es una cisteína proteasa con actividad fibrinolítica in vitro. La purificación de esta enzima de su organismo de origen resulta en cantidades limitadas y una baja pureza, además de ser un proceso costoso y laborioso. En esta investigación, empleamos tecnología de ADN recombinante para superar estas limitaciones. El objetivo fue producir la proteína FhT en su forma recombinante y evaluar su actividad fibrinolítica in vitro. Se clonó el gen de la forma zimógena de FhT (rProFhT) en el vector pPICZαC y se recombinó con el genoma de Pichia pastoris X-33. Se expresó rProFhT de 37 kDa y se purificó con un rendimiento de 20 mg/L. La activación de rProFhT a su forma enzimáticamente activa (rFhT) de 25 kDa se logró mediante la incubación con 10 mM de DTT y 1 mM de EDTA a pH 5 durante 8 horas. La enzima alcanzó su actividad óptima a un pH de 5 y mantenía actividad a pH 7 con el sustrato Z-Phe-Arg-pNA. Los parámetros cinéticos de la rFhT con este sustrato fueron Vmax 1.79 x 10-3 μmoles/min y Km 76.67 μM, valores similares a los de la enzima nativa FhT (Vmax 1.15 x 10-3 μmoles/min y Km 94.14 μM). Además, la enzima rFhT demostró actividad en la degradación de coágulos in vitro, comparables a los resultados obtenidos con la FhT nativa. En conclusión, se expresó y caracterizó bioquímicamente un nuevo agente trombolítico recombinante, rFhT, que muestra potencial para su desarrollo y evaluación como agente para el tratamiento de la trombosis.