Estandarización de una Técnica de PCR en Tiempo Real con Sondas TaqMan para la Detección de Leptospira spp Patógenas en Orina de Canes Domésticos - Sedano S., André (2016)
El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en orina de perro infectada in vitro con cepas patrón de Leptospira sp. Las muestras fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación. Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira sp y una sonda TaqMan Lepto probe que amplifican e hibridan, respectivamente, una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de Leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguida por una desnaturalización a 95 °C por 15 s y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60 °C por 1 min. Los valores de ciclo umbral (Ct) determinados durante la estandarización de la PCR estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira sp, en tanto que las cepas saprófitas y otros bacterias no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 102 con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R2) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 107 leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 102 leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87.